آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ( High Performance Liquid Chromatography) روشی بسیار کاربردی برای جداسازی، شناسایی و اندازه گیری مقادیر اندک یک نمونه است.
آنالیز HPLC که قبلاً به آن کروماتوگرافی مایع با فشار بالا گفته می شد روشی در شیمی تجزیه است که برای شناسایی و تعیین کمیت هر یک از اجزای موجود در یک مخلوط استفاده می شود.
آنالیز HPLC به پمپ های انتقال یک حلال مایع تحت فشار حاوی نمونه از طریق ستونی که با ماده جاذب جامد پر شده است، متکی است. هر یک از اجزاء موجود در نمونه با ماده جاذب به طور متفاوتی واکنش داده و باعث ایجاد جریان متفاوتی برای اجزای نمونه می شود که منجر به جدا شدن آنها می شود.
اصول کار آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا چیست؟
در آنالیز HPLC نمونه ای که باید جداسازی و بررسی شود در مقادیر بسیار اندک از طریق یک ستون به جریان فاز متحرک تزریق می شود. ستون های مختلفی وجود دارد که دارای جاذب هایی با اندازه و سطوح مختلفی از ذرات هستند.
مخلوط حاوی نمونه با سرعت های متفاوتی از ستون عبور کرده و با ماده جاذب که به عنوان فاز ثابت شناخته می شود، واکنش می دهد. سرعت هر جزء در مخلوط به 1) ماهیت شیمیایی آن، 2) ماهیت ستون و 3) ترکیب فاز متحرک بستگی دارد.
زمانی که یک آنالیت خاص در ستون پدیدار می شود، به عنوان زمان بازداری شناخته می شود. مدت زمان بازداری تحت شرایط خاص اندازه گیری می شود و به عنوان مشخصه شناسایی یک آنالیت معین در نظر گرفته می شود.
ذرات جاذب ممکن است از نظر طبیعت آبگریز یا قطبی باشند. فازهای متداول مورد استفاده شامل ماده قابل ترکیب با آب و حلال های آلی مانند استونیتریل و متانول است. از فازهای متحرک بدون آب نیز می توان استفاده کرد.
اجزاء محلول فاز متحرک ممکن است حاوی اسیدهایی مانند اسید فرمیک، اسید فسفریک یا تری فلوئوراستیک و یا نمک باشد تا جداسازی اجزای نمونه را فعال کند. ترکیب فاز متحرک در طول کروماتوگرافی می تواند به صورت ثابت یا متغیر حفظ شود.
روش ثابت برای جداسازی اجزای یک نمونه که از نظر میل برای فاز ثابت خیلی متفاوت نیستند، مؤثر است. در روش متغیر، ترکیب فاز متحرک از استحکام شستشوی کم تا زیاد متفاوت است.
استحکام شستشوی فاز متحرک توسط زمان های بازداری آنالیت منعکس می شود که در آن قدرت شستشوی زیاد باعث شستشوی سریع می شود. ترکیب فاز متحرک بر اساس شدت برهم کنش بین چندین جزء نمونه و فاز ثابت انتخاب می شود.
شایان ذکر است که فرایند پارتیشن بندی HPLC کاملاً مشابه فرایند استخراج مایع - مایع است به جز اینکه اولی یک فرایند مداوم است و روش دوم یک فرایند گام به گام است. توصیه می شود از فرآیندهای پارتیشن بندی برای تعیین روش دقیق HPLC که امکان جداسازی کافی نمونه را فراهم می کند، استفاده شود.
مزایای اصلی سیستم های HPLC به شرح زیر است:
کاربردهای آنالیز HPLC:
هدف اصلی تکنیک HPLC شناسایی، تعیین کمیت و خالص سازی یک آنالیت یا ترکیب خاص است. تجزیه و تحلیل کمی و هم کیفی با HPLC قابل انجام است و می توان آن را برای موارد زیر استفاده کرد:
بخش های مختلف دستگاه آنالیز HPLC:
پمپ HPLC:
پمپ HPLCمهم ترین بخش دستگاه است و پمپاژ حلال و یا حلال ها با فشار بسیار بالا تا حدود 40 مگا پاسکال و یا بیشتر را به سمت ستون کروماتوگرافی انجام می دهد.
پمپ می تواند از یک تا چهار حلال را به سمت ستون پمپاژ می نماید که بسته به روش کار تغییر می کند. در مواقعی که از یک حلال در دستگاه HPLC استفاده می شود به آن ایزوکراتیک یا تک حلاله گفته می شود.
در مواقعی که از ترکیب ثابت دو یا چند حلال و یا ترکیب متغیر با برنامه زمانی استفاده شود به این سیستم باینری و یا کواترنری یا چند حلاله و یا گرادیانت می گویند.
انژکتور HPLC:
انژکتور ابزار تزریق کننده نمونه به داخل حلال عبوری در دستگاه کروماتوگراف است. این بخش سیستمی است متشکل از چند مسیر که بین پمپ و ستون قرار گرفته و می تواند در حین عبور حلال یا فاز حامل با فشار زیاد مقدار معینی از نمونه را به داخل آن هدایت نماید.
مقدار ثابت نمونه در داخل لوله ای با حجم مشخص بنام لوپ قرار می گیرد تا در لحظه فرمان کاربر سوار موج حلال شده و به سمت ستون کروماتوگرافی حرکت نماید. انژکتور اتوماتیک و یا Autosampler نیز نوع رباتیک این سیستم می باشد که می تواند تعداد بسیار زیادی از نمونه را طبق برنامه به داخل حلال تزریق نماید.
ستون HPLC:
ستون کروماتوگرافی مرکز جداسازی اجزای نمونه و به صورت لوله ای است که با مواد نیمه تراوا از جنس خاک دیاتومه با خلل و فرج فراوان پر شده است. حلال و نمونه حل شده تنها با اعمال فشار از داخل آن عبور داده می شود.
این ستون ها در واقع کار نگهداری و رها سازی مولکول های موجود در ترکیب را به ترتیب بزرگی و یا چسبندگی مولکول ها و قدرت شستشوی نمونه توسط حلال انجام می دهند. ستون ها بسته به جنس محتوا و قطبیت و طول دارای انواع بسیار متنوعی هستند.
آشکار ساز یا Detector:
دتکتور غلظت نمونه را دستگاه کروماتوگراف مایع اندازه گیری می کند. در بیشتر موارد دتکتور یک سیستم اسپکتروفتومتر است که در یک طول موج خاص مقدار و نوع نمونه را مشخص می کند.
کنترل کننده Controller:
کنترل کننده بخشی است که ماژول های دیگر را کنترل نموده و ارتباط همه بخش ها و کامپیوتر را برقرار می نماید. در پایان اطلاعات اجزای ترکیب به صورت نمودار یا اصطلاحاً کروماتوگراف روی نمایشگر قابل دستیابی است.
دگسر Degasser:
قبل از ورود حلال به داخل پمپ باید هر گونه حباب هوا، گاز و یا هوای حل شده در حلال را در آن از بین برد. این کار به دو روش تزریق گاز بی اثر مثل آرگون در داخل حلال در حین تکان دادن حلال یا استفاده از دستگاه گازگیر یا دگسر صورت می گیرد. که استفاده از دستگاه Degasserمتداول تر است.
از دیگر بخش های یک دستگاه آنالیز HPLC می توان به کنترل کننده دمای ستون و میکسر اشاره کرد که حلال ها و نمونه را قبل از تزریق به ستون به صورت همگن مخلوط می نماید.
هزینه و دقت آنالیز HPLC:
HPLC در علوم آزمایشگاهی و بالینی کاربردهای زیادی دارد و به عنوان یک روش متداول در توسعه داروسازی مورد استفاده قرار می گیرد، زیرا روشی قابل اعتماد برای به دست آوردن و اطمینان از خلوص محصول است.
با اینحال HPLC در مقیاس بزرگ می تواند یک روش گران قیمت باشد و افزایش ویژگی، دقت و صحت HPLC باعث افزایش هزینه ها خواهد شد.
|
|
|
|
| نماد اعتماد الکترونیک | نشان ملی ثبت | گواهی شامد ارشاد |
© کلیه حقوق مادی و معنوی این وب سایت متعلق به داده پردازان هومان پویان می باشد.
