محیط کشت و انواع آن

محیط کشت و انواع آن:
محیطی که در آن شرایط لازم برای رشد دادن سلول ها، میکروارگانیسم ها و حتی گیاهان کوچک به وجود می آید، محیط کشت نامیده می شود. این محیط مایعی یا ژله ای تمام مواد مغذی لازم اعم از ویتامین ها، آمینواسیدها، گلوکز، نمک های معدنی و … را دارا می باشد. 

مقدمه و تعریف محیط کشت:
میکروب ها موجوداتی تک سلولی هستند و به طور مستقل به حیات خود ادامه می دهند. این موجودات تک سلولی برای ادامه حیات و رشد و تکثیر، به تمام مواد معدنی و غذایی احتیاج دارند. محیطی که تمام ملزومات زندگی سلول ها را دارد و اصطلاحا یاخته ها در آن کشت می شوند را محیط کشت یا محیط رشد می گویند.

سلول ها با توجه به نوع کشتشان در ظرف های مختلفی رشد داده می شوند. اگر محیط مایع باشد رشد میکروب ها در لوله انجام می شود و اگر محیط جامد باشد، کشت آن ها هم در پلیت و هم در لوله انجام می شود.

 تعریف آگار:
آگار ماده ای پلی ساکاریدی و جامد که تهیه شده از جلبک قرمز دریایی است. دمای ذوب آن 95 و دمای انعقاد آن 43 درجه سانتی گراد است. به دلیل این بازه دمای ذوب و انعقاد این ماده و دمای کشت 37 درجه سانتی گراد، از آگار در محیط های رشد استفاده می شود.

محیط کشت طبیعی و مصنوعی:
محیط کشت می تواند طبیعی باشد و یا به شکل مصنوعی فراهم شود. محیط های رشد طبیعی مانند مایعات بیولوژیکی و پلاسما را می توان نام برد. از بهترین محیط های رشد طبیعی خون است که تمام مواد لازم برای رشد یک سلول، اعم از اکسیژن، دمای مناسب، مواد تغذیه ای و شرایط لازم دیگر را دارد. چون ترکیبات این محیط های رشد مشخص نیست نمی توان آن ها را دوباره ساخت. محیط های رشد مصنوعی را با ترکیب تمام موادی که برای رشد سلول لازم است مانند ویتامین ها، نمک ها، کربو هیدرات ها، گازهای اکسیژن و …می سازند.

انواع محیط کشت بر اساس حالت فیزیکی:
بر این اساس محیط های رشد به سه دسته جامد، مایع و نیمه جامد تقسیم می شوند.

محیط رشد جامد (Solid Media):

• این محیط ها دارای آگار بوده و برای تشخیص باکتری ها و پاتوژن ها به کار می رود. این محیط ها درون لوله آزمایش (برای کشت های عمیق) و یا پلیت (ظروف پتری دیش) انجام می شود و آگار این محیط ها بعد از سرد شدن منعقد می شود. از این نوع کشت ها می توان به نوترینت آگار و بلاد آگار اشاره کرد.

محیط رشد مایع (Liquid Media):

• از این محیط کشت که فاقد آگار است، در تست های بیوشیمی استفاده می شود. این محیط ها در لوله آزمایش و یا فلاسک انجام می شود.

محیط کشت نیمه جامد (Semi Solid Media):

• این محیط ها درصد کمی آگار مثلا نیم درصد، دارند و نیمه جامد می مانند. از آن ها به عنوان محیط انتقالی استفاده می شود.

انواع محیط کشت از لحاظ کاربرد در آزمایشگاه:

• محیط رشد عمومی (پایه) (Basic Media):
  اساس ساخت انواع محیط های رشد، محیط رشد پایه است که از نظر مواد مغذی دارای کمترین حد است. این محیط برای رشد میکروب هایی مناسب است که محیط های تخصصی برای رشد و تکثیر لازم ندارند. این محیط برای رشد انواع سلول ها مناسب است. نوترینت آگار و نوترینت براث از این نوع محیط هاست.
• محیط رشد غنی شده (Enriched Media):
  این محیط که برای بیشتر سلول ها و میکروب ها به کار می رود محیطی است که از نظر مواد مغذی (ویتامین ها، لیپیدها، اسید های آمینه و…) غنی می باشد و بیشتر مواد مورد نیاز برای تکثیر سلول ها را داراست. این محیط با خون یا سرم غنی می شود و بلاد آگار یک نوع از این محیط است. میکروارگانیسم استرپتوکوکی می تواند در این نوع محیط تکثیر شود.
• محیط رشد انتخابی (Selective Media):
  در این محیط ها شرایطی برای رشد و کشت گروه خاصی از سلول ها فراهم است و با انتخاب و اضافه کردن عامل مناسب، از رشد باکتری های نامناسب جلوگیری شده و سلول ها و باکتری های خاص مورد نظر و مناسب رشد می کنند. به عنوان مثال عامل انتخابی استافیلوکوک ها، سدیم کلرید است که باعث کشت مطلوب آن ها می شود. مثالی دیگر محیط تلوریت است که می تواند با مانع شدن از رشد باسیل دیفتری، باعث رشد بقیه باکتری های گلو شود.
• محیط رشد افتراقی (Differential Media):
  این محیط ها برای جدا رشد کردن نوع خاصی از باکتری ها مناسب است. به عبارتی دیگر وجود برخی عوامل در این محیط ها باعث می شود که برخی باکتری ها نسبت به باکتری های دیگر در همان محیط به شکل متفاوتی رشد کنند و کلونی باکتری های مختلف با هم متفاوت است (رنگ های مختلفی می دهد). به عنوان مثال محیط مکانکی آگار که در آن کلونی های تخمیر کننده لاکتوز به رنگ قرمز و کلونی های باکتری هایی که تخمیر لاکتوز نمی کنند بی رنگ هستند.
• محیط رشد کامل (Complete Media):
  این محیط اولا فاقد مواد ضد میکروب بوده و ثانیا از نظر مواد غذایی لازم برای رشد میکروارگانیسم ها و سلول ها، کامل است و به این دلیل بیشتر باکتری ها می توانند در این محیط ها رشد کنند. در این محیط ها هیچ شاخصی نیست و هیچ تغییر رنگی نداریم.
• محیط رشد ترابری (Transport Media):
  وقتی نمونه های بالینی آماده می شود برای انتقال به آزمایشگاه از این محیط های کشت استفاده می شود. چون در انتقال نمونه ها ممکن است آن ها خشک شوند و یا باکتری های ناخواسته رشد کنند، و یا نمونه آلوده شود. همچنین با افزودن زغال مانع رشد باکتری های ناخواسته می شویم. از این محیط ها می توان به کری بلیر اشاره کرد.

 وجود سرم در محیط کشت:
سرم به عنوان منبعی از بیشتر مواد مورد نیاز رشد و تکثیر سلول ها مانند آمینواسیدها، پروتئین ها، ویتامین های محلول در چربی (A, D, K, E)، اسید های چرب، قندها، هورمون ها (برای عملکرد بهتر سلول)، مواد معدنی (سدیم، پتاسیم)، عناصر کمیاب (روی و آهن و..) و فاکتورهای رشد، اصلی ترین بخش ترکیبی محیط رشد است. سرم به عنوان بافر PH محیط رشد را ثابت نگه می دارد.

توجه:
استفاده از سرم گاهی عیب هایی دارد. به عنوان مثال ترکیبات سرم همیشه ثابت نیستند و باید قبل از استفاده باید از نظر مواد تشکیل دهنده بررسی شوند. حتی ممکن است دارای برخی عوامل مانع رشد سلول باشد و باعث آلودگی محیط شود. همچنین استفاده از سرم جداسازی محصولات کشت را دچار اختلال می کند.

عناصر و ترکیبات تشکیل دهنده محیط های کشت:
کربن در کربو هیدرات:

• منبع کربن کربوهیدرات ها یا قندها ست که وظیفه تامین انرژی سلول را به عهده دارد. نوع قندی که برای تامین انرژی در محیط های رشد استفاده می شود به توانایی سلول در استفاده از قندها بستگی دارد. در بعضی محیط ها از گلوکز و گالاکتوز و در برخی دیگر مالتوز استفاده می شود.

آمینو اسیدها:

• آمینو اسیدها چون برای ساخت پروتئین ها لازم است در همه محیط های رشد موجود است. سلول ها برای رشد خود به انواع آمینو اسیدها نیاز دارند که برخی از آن ها را خودشان تولید می کنند و برخی دیگر را از محیط کشت تامین می کنند.

لیپید ها و اسید های چرب:

• چون سرم ها حاوی اسیدهای چرب هستند پس اضافه کردن اسیدهای چرب در محیط های سرم دار لازم نیست. در محیط بدون سرم برای رشد سلول باید لیپید اضافه شود.

ویتامین ها:

• ویتامین ها رشد سلول و تکثیر آن ها را بهبود می دهند. چون ویتامین ها توسط سلول ها ساخته نمی شوند پس باید به محیط کشت اضافه شوند. در محیط های کشت حاوی سرم ویتامین های محلول در چربی در محیط وجود دارد و لازم به اضافه کردن آن ها نیست.

نمک های غیرآلی:

• سلول ها در محیط های رشد نیازمند برقرای رابطه بین خود هستند و این از طریق غشا انجام می شود که باید با این ارتباط غلظت محلول نمکی تنظیم شود. با افزودن یون هایی مثل سدیم، پتاسیم و کلسیم به عنوان نمک های غیر آلی تعادل اسمزی حفظ و پتانسل غشای سلول تنظیم می شود.

رنگ فنول رد:

• رنگ ها به عنوان شناساگر PH و ناظر بر تنظیم آن هستند و رنگ آن ها متناسب با مواد رها شده توسط سلول ها تغییر می کند. در PH های پایین رنگ محیط زرد و در PH های بالا رنگ بنفش و در بهترین شرایط رشد باکتری، محیط قرمز است.

سیستم بافری:

• بافر به عنوان تنظیم کننده PH نقش مهمی در رشد سلول دارد. یکی از راه های تنظیم اسیدیته که بسیار کم هزینه نیز می باشد، با گاز دی اکسید کربن است که از ترکیبات کربنات محیط رشد آزاد می شود و سیستم بافری طبیعی و غیر سمی است. HEPES یکی دیگر از این سیستم هاست که به گازهای جوی نیازی نیست و سیستمی شیمیایی و کم هزینه بوده و دارای زویتریون است.

عناصر کمیاب و مکمل های محیط کشت:

• عناصری چون روی، مس، سلنیوم و… به محیط های بدون سرم اضلفه می شوند. وجود این عناصر برای فرآیندهای چون تولید آنزیم لازم و ضروری است. محیط های کشت کامل باید مکمل هایی داشته باشد که در محیط های پایه و سرم نیست. به این محیط های رشد که برای رشد و تکثیر سلول های خاص لازم است ترکیباتی مثل هورمون و فاکتورهای رشد (البته با احتیاط) اضافه می شود.

آنتی بیوتیک ها:

• از آنتی بیوتیک ها وقتی استفاده می شود که در محیط رشد آلودگی های قارچی و باکتریایی باشد. استفاده زیاد از آنتی بیوتیک ها باعث اختلال در متابولیسم سلول های حساس و مخفی شدن آلودگی حاصل از باکتری های مقاوم می شود.

محیط های کشت پر کاربرد:
محیط های رشدی که برای رشد میکروارگانیسم ها به کار گرفته می شوند بسیار فراوان است. در این جا به چند نمونه اشاره می کنیم.

محیط رشد نوترینت آگار (Nutrient Agar):
دارای یک و نیم تا دو درصد آگار است و زیر ساختار تمام محیط های رشد جامد است.

محیط رشد نوترینت برات (Nutrient Broth):
این محیط از عصاره گوشت به دست می آید و اساس و پایه برای تهیه بسیاری محیط های دیگر است و در لوله آزمایش انجام می شود.

محیط رشد آگار خون دار (Blood Agar):
این محیط برای اکثر نمونه های میکروب شناسی کاربرد دارد و پایداری حدود یک هفته ای در یخچال دارد. با مانع تبخیر شدن آب در آن ماندگاری آن بالا می رود.

محیط رشد شکلات آگار (Chocolate Agar):
با حرارت دادن محیط رشد پایه و استریل کردن، گلبول های قرمز خراب شده و محیط را تیره می کند. این محیط تیره حاوی هموگلوبین فراوان و مواد غذایی است و باعث رشد میکروب ها و سلول ها می شود.

محیط رشد OF آگار:
این محیط برای سنجش قدرت باکتری ها در تخمیر و اکسیداسیون است و نسبت به نور خورشید حساس می باشد. باکتری های تخمیر کننده محیط را اسیدی و رنگ بروموتیمول را زرد می کنند.