معرفی بلاد آگار ( یا آگار خون دار)

بلاد آگار ( یا آگار خون دار) چیست؟
بلاد آگار یک محیط کشت جامد مغذی است که حاوی گلبول های قرمز خونی است و برای کشت میکروارگانیسم هایی که به سختی رشد می کنند به کار می رود. همچنین این محیط برای رشد باکتری های بیماری زا استفاده می شود.

محیط کشت چیست؟
محیطی که به شکل جامد، مایع و یا نیمه جامد، تمام مواد لازم برای رشد و تکثیر میکروارگانیسم ها را دارا می باشد و باکتری ها در آن رشد و تکثیر می یابند به محیط کشت معروف است. از این محیط ها در آزمایشگاه های بیولوژیکی، بررسی سلول های بدن، بررسی میکروب ها و باکتری های مختلف و در کل برای کارهای تحقیقاتی استفاده می شود.

این محیط ها باید تمام مواد لازم از قبیل کربوهیدرات ها، آمینو اسیدها، ویتامین ها، فاکتور های رشد و.. را داشته باشند. محیط های کشت با توجه به نوع کاربرد آن ها انواع مختلفی دارند که یکی از آن ها نوع جامد آگار دار است. یکی از انواع آگار دار نیز نوع خون دار آن می باشد.

محیط کشت آگار چیست؟
محیطی کشتی جامد با مواد مغذی که به شکل پتری دیش های حاوی آگار است. میکروارگانیسم ها وارد دیش شده و شروع به رشد می کنند و کلونی های میکروارگانیسم ها را ایجاد می کنند. بعضی از مواقع به پلیت آگار مورد نظر آنتی بیوتیک اضافه می کنند تا مانع رشد و تکثیر باکتریهای مخرب شوند. محیط های کشت آگار متنوعی جود دارد که یکی از پرکاربردترین آن ها محیط کشت بلاد آگار یا آگار خون دار است.

محیط کشت بلاد آگار چیست؟
این محیط کشت محیط جامدی سرشار از مواد مغذی و یک محیط غیرانتخابی برای رشد و تکثیر باکتری های بیماری زایی چون هموفیلوس آنفولانزا و استرپتوکوک پنومونیه است. این محیط از 5 تا 10 در صد سلول های خونی تشکیل شده است (مثل خون گوسفند یا خرگوش).

برای ساخت این محیط ابتدا به آب پپتون، عصاره قلبی، عصاره مخمر و کلرید سدیم (برای تعادل اسمزی) اضافه شده، استریل می شود. سپس خون استریل شده (به عنوان فاکتور رشد) به آن اضافه می شود. اگر استرپتوکوکی مد نظرباشد از خون خرگوش و اگر باکتری هموفیلوس پارا همولیتیکوس مدنظر باشد از خون گوسفند استفاده می شود.

نقش ترکیبات:
نیتروژن، کربن و ویتامین در محیط کشت خون دار آگار، با هضم آنزیمی بافت حیوانی و casein تهیه می شود. ویتامین ها و نشاسته هم با اضافه کردن عصاره مخمر برای رشد و تکثیر زیاد باکتری ها به محیط اضافه می شوند. علت افزودن کلرید سدیم برای حفظ تعادل اسمزی است و آگار برای حفظ حالت جامد محیط است. در این محیط ها لاکتوز یک کربو هیدرات است و نقش بافر را دی پتاسیم فسفات بازی می کند.

طرز تهیه محیط بلاد آگار:
در ابتدا با توجه با اجزای سازنده پودر آگار مغذی (حاوی آگار، عضله قلبی، سدیم کلرید و…)، آن را به آب مقطر اضافه کنید. مخلوط را حرارت می دهیم تا پودر کاملا حل شود. ترکیب را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گراد اتوکلاو می کنیم.

در مرحله بعد به آگار مغذی باید اجازه داده شود تا خنک شود. وقتی دمای ترکیب به 45 تا 50 درجه سانتی گراد رسید به اندازه 5 درصد از وزن ترکیب، به آن خون گرم شده استریل در دمای اتاق را اضافه کرده خوب هم می زنیم. با جلوگیری از تشکیل حباب در هنگام هم زدن، محیط کشت آماده شده را استریل می کنیم. PH این محیط ها بین 7.2 و 7.6 است.

استفاده از محیط کشت بلاد آگار در همولیز:
یکی از مهم ترین کاربردهای محیط کشت آگار خون دار برای شناسایی باکتری هایی است که تولید آنزیم همولیز را انجام می دهند. در فرآیند همولیز هموگلوبین از گلبول های قرمز آزاد می شود. با تعیین مقداری از سلول های خونی که همولیز شدند باکتری ها از هم تفکیک می شوند.

توجه:
قبل از اضافه کردن خون به محیط آگار خون را دفیبرینه می کنند و فیبرین آن را خارج می کنند. چون وجود فیبرین در خون باعث لخته شدن آن می شود و تشخیص واکنش های همولیتیک را با اشکال مواجه می کند.

انواع همولیز:
سه نوع همولیز آلفا، بتا و گاما داریم. در همولیز آلفا رنگ سبزی اطراف کلونی باکتری رشد کرده، تشکیل می شود و این نوع همولیز تجزیه جزئی هموگلوبین گلبول های قرمز را نشان می دهد. این همولیز خصوصیت جدا کننده باکتری استرپتوکوک به نام پنومونیه است.

در همولیز بتا اطراف کلونی باکتری به صورت شفاف قابل مشاهده است و تجزیه هموگلوبین گلبول های قرمز به طور کامل انجام می شود. این همولیز مربوط به باکتری استرپتوکوک پیوژنس است.

در همولیز گاما، در واقع هیچ همولیزی وجود ندارد. در این نوع همولیز محیط بلاد آگار به رنگ قهوه ای دیده می شود. این نوع همولیز مربوط به باکتری انتروکوکوس فکالیس می باشد.

نکته:
با تشخیص نوع همولیز انواع باکتری ها شناسایی می شود و با انجام آزمایش های بیوشیمیایی می توان به طور دقیق نوع این باکتری ها را تعیین کرد و این موضوع بسیار مهم است.

تفاوت محیط های کشت بلاد آگار (Blood Agar) و شکلات آگار (Chicilate Agar):
همان طور که گفته شد محیط کشت خون دار آگار محیطی غنی شده برای رشد باکتری های سخت رشد، است و از آن برای شناسایی باکتری های تولید کننده آنزیم همولیز استفاده می شود.

اما محیط کشت غنی شده ای که دارای گلبول های با غشای تخریب شده (لیز شده) است و رنگ آن قهوه ای می باشد را شکلات آگار می گویند. وقتی غشای گلبول های قرمز خراب شد، ترکیبات داخل سلول مانند هموگلوبین و برخی آنزیم ها از آن خارج می شوند که به رشد باکتری ها کمک می کند.

تفاوت ها:
تمام اعضای تشکیل دهنده بین دو محیط کشت یکی است، فقط در محیط شکلات آگار، گلبول های قرمز لیز شده (غشا مخرب) وجود دارند. تفاوت دیگر در این است که خون گرم شده در محیط کشت شکلات آگار قبل از سرد شدن محیط و در همان دمای 80 درجه سانتی گراد اضافه می شود.

همین دمای بالاست که باعث تخریب غشای گلبول های قرمز و خارج شدن ترکیبات آن می شود.محیط شکلات آگار چون فاکتورهای hermin و NAD دارد باکتری سخت رشدی چون هموفیلوس ها به راحتی در آن رشد می کند.