دستگاه الایزا ریدر چیست؟

دستگاه الایزا ریدر چیست؟
دستگاه الایزا ریدر
الایزا ریدرها که به آنها پلیت ریدر و یا میکروپلیت ریدر نیز گفته می شود، ابزارهایی هستند که در تشخیص رویدادهای زیست شناسی، شیمیایی یا فیزیکی نمونه ها در صفحه های میکروتیتر مورد استفاده قرار می گیرند. این دستگاه کاربرد گسترده ای در کشف دارو، اعتبارسنجی های زیست شناسی، کترل کیفیت و فرآیندهای تولید در صنایع دارویی و زیست فناوری دارد. فرمت های رایج تر میکروپلیت که در تحقیقات آکادمیک و آزمایشگاه های تشخیص طبی مورد استفاده قرار می گیرد دارای 96 چاهک(ماتریس 8 در 12) است. میکروپلیت های سنگین تر(که 384 یا 1536 چاهک دارند)، عموما برای غربالگری ها مورد استفاده قرار می گیرد وتوان را افزایش و هزینه را کاهش می دهد.

حالت های تشخیصی رایج دستگاه میکروپلیت ریدر شامل جذب، مشاهده فلورسانس، لومینسانس، قطبش فلوئورسانس و Time-resolved fluorescence است.

جذب
تشخیص جذب در میکروپلیت ریدرها بیش از سه دهه است که قابل دسترس است و برای اعتبارسنجی هایی نظیر الایزا، اندازه گیری پروتئین و نوکلئیک اسید یا فعالیت آنزیم استفاده می شود. یک منبع نور نمونه را با استفاده از طول موج خاص (انتخاب شده توسط یک قطعه نوری یا مونوکروماتور) روشن می کند و یک ردیاب نور که در طرف دیگر چاه قرار دارد، مقدار نور عبوری از طریق نمونه را اندازه گیری می کند. مقدار نور عبور داده شده، عموما به غلطت مولکول مورد نظر مربوط است. ارزیابی آمونیوم، نیترات، نیتریت، اوره، آهن و اورتوفسفات، نمونه هایی از آنالیزهایی هستند که به روش میکروپلیت ریدر تبدیل شده اند.بیشتر رنگ سنجی های شیمیایی اخیر، به طور مستقیم برای استفاده در میکروپلیت ریدر توسعه یافته اند.

فلورسانس
تشخیص فلوئورسانس در فرمت میکروپلیت به طور گستره در دو دهه ی اخیر گسترش یافته است.طیف کاربردهای آن بسیار گسترده تر از استفاده از جذب است اما این ابزار غالبا گران تر است.در این نوع ابزار، اولین سیستم نوری، نمونه را با استفاده از طول موج خاصی روشن می کند.در نتیجه ی این روشنایی، نمونه نور ساطع می کند و سیستم نوری ثانویه، این نور ساطع شده را جمع آوری می کند و آن را(با استفاده از یک فیلتر یا سیستم مونوکروماتور) از نور خارجی مجزا می کند و این سیگنال را با استفاده از یک ردیاب نوری همانند لوله ی فوتومولتیپلر اندازه گیری می کند.از مزایای این روش نسبت به مشاهده ی جذب، حساسیت است؛ و دامنه ی کاربرد که انتخاب گسترده ای از برچسب های فلورسنتی که امروزه موجود هستند، به دست می دهد. به عنوان مثال، تکینیکی که تصویربرداری کلسیمی نامیده می شود، شدت رنگهای حساس به کلسیم را برای ارزیابی میزان کلسیم داخل سلولی اندازه گیری می کند.

لومینسانس
لومینسانس نتیجه ی یک واکنش شیمیایی یا زیست شناسی است.ردیابی لومینسانس از لحاظ نوری ساده تر از فلورسانس است؛به این دلیل که لومینسانس نیازی به یک منبع نور برای تحریک ندارد.

یک سیستم نوری لومینسانس تشکیل شده از یک محفظه ی خوانش نور و یک ردیاب PMT. برخی از پلیت ریدر ها یک ردیاب PMT آنالوگ را بکار می برند درحالی که بقیه دستگاه ها، یک ردیاب شمارنده ی فوتون دارند. شمارنده ی فوتون به طور گسترده ای به عنوان حساس ترین وسیله تشخیص لومینسانس پذیرفته شده است.برخی پلیت ریدر ها چرخ های فیلتر یا سیستم های نوری سنجش طول موج مونوکروماتور قابل تنظیم را برای انتخاب طول موج های لومینسانس خاص را پیشنهاد می دهند.

قطبش فلورسانس
این تکنیک نیز بسیار شبیه به ردیابی FI است.تنها تفاوت دراین است که این سیستم شامل فیلترهای پولاریزاسیون است که در مسیر نور قرارگرفته اند. نمونه های داخل میکروپلیت با استفاده از نور پولاریزه(قطبیده شده) تحریک می شوند. بسته به تحرک مولکول های فلورسنتی که در چاه ها هستند، نور ساطع شده می تواند پولاریزه یا غیرپولاریزه باشد.برای مثال، مولکول های بزرگ موجود در محلول(مثل پروتئین) که به خاطر اندازه شان نسبتا آرام می چرخند، وقتی با نور پولاریزه تحریک می شوند، نور پولاریزه را ساطع می کنند.از سوی دیگر، چرخش سریع مولکول های کوچک تر، سبب دپولاریزه شدن سیگنال می شود.سیستم تحریک در این پلیت ریدر، فیلترهای پولاریزه رابرای بررسی پولاریزه بودن (قطبیدگی) نور ساطع شده بکار می برد.سطح پایین پولاریزاسیون، نشان می دهد که مولکول های کوچک آزادانه در محلول حرکت می کنند.سطح بالای قطبیدگی نور ساطع شده نشان دهنده ی این است که فلورسنت به یک کمپلکس مولکولی بزرگ تر متصل شده است. در نتیجه، یکی از اساسی ترین کاربردهای ردیابی FI، ارزیابی اتصال مولکولی است؛زیرا می توان تشخیص داد که آیا یک مولکول کوچک فلورسنت به یک مولکول بزرگ تر غیرفلورسنت متصل شده یا نه؛ بدین صورت که اتصال سبب کاهش سرعت چرخش مولکول فلورسنت، و درنتیجه افزایش پولاریزاسیون می شود.

Time-resolved fluorescence

Time-resolved fluorescence یا TRF بسیار شبیه به اندازه گیری شدت فلورسانس (FI) است. تنها تفاوت آنها در زمان بندی فرایند تحریک / اندازه گیری است. هنگام اندازه گیری FI، فرایندهای برانگیختگی و انتشار همزمان هستند و نور ساطع شده توسط نمونه در حین تحریک اندازه گیری می شود.هرچند سیستم های انتشار در از بین بردن نور تحریک قبل از رسیدن به ردیاب بسیار کارآمد هستند، میزان نور تحریک در مقایسه با نور انتشار به گونه ای است که اندازه گیری FI همیشه سیگنال های پس زمینه نسبتاً بالایی را نشان می دهد. TRF راه حلی برای این مشکل ارائه می دهد که مبتنی بر استفاده از فلورسنت های خاص تحت عنوان لانتانیدها است که این خاصیت را دارند که پس از گذشت مدت طولانی از تحریک (در حدود میلی ثانیه)، از خود نور ساطع می کنند؛در صورتی که بیشتر رنگ های فلورسنت استاندارد فقط تا چند نانوثانیه پس از برانگیخته شدن، نور منتشر می کنند.در نتیجه می توان لانتانیدها را با استفاده از یک منبع نور پالس تحریک کرد و بعد نتیجه را اندازه گیری کرد.در این صورت پالس های زمینه ای در مقایسه با سنجش استاندارد FI کمتر خواهد بود..اشکالاتی که وجود دارد این است که ابزارها و معرف ها معمولا گران هستند و این که کاربردها باید سازگار با استفاده از رنگ های لانتانید خیلی خاص باشند.کاربرد اصلی TRF در غربالگری دارو، تحت عنوان TR-FRET (time-resolved fluorescence energy transfer) یافت می شود.سنجش TR-FRET بسیار مقاوم است و می توان به راحتی آن را در مقادیر کوچک بکار برد.استحکام، قابلیت خودکارسازی و کوچک سازی ویژگی های مورد توجه در آزمایشگاه غربالگریست.

پراکندگی نور و نفلومتری

پراکندگی نور و نفلومتری، روش هایی برای تعیین قسمت حل نشده ی یک محلول هستند.یک باریکه ی نور از نمونه عبور داده می شود و این نور توسط ذرات معلق پراکنده می شود.نور پراکنده ای که در قسمت دیگر محلول اندازه گیری می شود، نشان دهنده ی مقدار ذرات حل نشده ی موجود در محلول است.کاربردهای رایج پراکندگی نور/نفلومتری، شامل غربالگری خودکار حلالیت دارو، سینتیک رشد میکروبی طولانی مدت، لخته سازی و… است.

ابزارها و ارزیابی ها

بسیاری از روش های تشخیصی(جذب، فلورسنت، لومینسنس و….) به صورت مستقل در میکروپلیت های اختصاصی در دسترس هستند، اما اغلب به صورت ترکیب شده در یک دستگاه یافت می شوند. همچنین ابزارهایی برای اندازه گیری نور دینامیک و استاتیک پراکنده شده از نمونه ها در میکروپلیت موجودند. محدوده ی کاربرد میکروپلیت ریدرهای چندحالته بسیار وسیع است. برخی از رایج ترین کاربردهای این دستگاه ها عبارتند از:

الایزا

ارزیابی پروتئین و رشد سلولی

اینتراکشن های پروتئین-پروتئین

ارزیابی نشانگرها

کمیت نوکلئیک اسید

اینتراکشن های مولکولی

فعالیت آنزیمی

سمیت سلولی

کمیت ATP

ایمنی سنجی

کشف دارو

درحالی که پلیت ریدر عموما به موارد گفته شده در بالا اشاره دارد، ابزارهای متنوع دیگری نیز در دسترسند.چند نمونه از دستگاه هایی که با فرمت میکروپلیت ریدر کار می کنند عبارتند از:

-پلیت ریدر های ELISPOT:برای شمارش لکه های رنگی که در دوره سنجش ELISPOT شکل می گیرند، استفاده می شوند.

- High-content screening (HSC): سیستم های غربالگری که هر چاه را برای ردیابی جمعیت سلولی با وضوح بالا تصویرسازی می کنند.

-ابزارهای بدون لیبل که از میکروپلیت های تخصصی برای اندازه گیری وقایع اتصال، بدون استفاده از نشانگر های شیمیایی استفاده می کنند.

Gel documentation system

Gel documentationبه ابزاری گفته می شود که به طور گسترده در آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی برای تصویرسازی و مستندسازی اسید نوکلئیک و پروتئین های نشاندار شده در ژل های پلی آکریلامید یا آگارز یا سلولز مورد استفاده قرار می گیرد. این ژل ها به طور معمول توسط اتیدیوم برومید یا سایر رنگ های اسید نوکلئیک مانند GelGreen، رنگ می شوند. سیستم ها بسته به توان و نوع نمونه، تنظیمات متنوعی دارند. به طور کلی، یک ژل داک شامل یک منبع نور ماوراء بنفش (UV)، یک هود یا اتاق تاریک برای محافظت از منابع نوری خارجی و محافظت از کاربر در برابر اشعه ماوراء بنفش، و یک دوربین CMOS برای ثبت تصویر است. ژل الکتروفورز در اتاق تاریک قرار می گیرد و نور (عموما فلورسانس) به ژل تابانده می شود؛ در نتیجه نشانگر هایی که به پروتئین یا DNA متصل شده و نسبت به نور حساسیت نشان می دهند، با تابش نور مرئی، پروتئین و یا DNA را به صورت رنگی نشان می دهند.و دوربین مخصوص عکس آن را ثبت می کند؛سپس اطلاعات مربوطه به وسیله ی نرم افزار های خاص قابل بررسی است.

مدلهای تصویری که اخیراً تولید شده اند همچنین شامل ویژگی هایی برای کنترل انواع فلورسانس و لومینسانس با دوربین هایی هستند که تا 60- درجه سانتیگراد خنک شده اند. سایر ویژگی های پیشرفته عبارتند از: چاپ سریع روی دوربین و اتصال به Wi-Fi جهت کنترل توسط تلفن های هوشمند و تبلت.

کاربردها
تصویربرداری از ژل و بلات

شمارش کلنی

ایمنی سنجی

تشخیص پروتئین

تعیین تغییرات پس از ترجمه

الکتروفورز دو بعدی

کمیت پروتئین

انواع سیستم های ژل Doc

نوع سیستم های مستندسازی ژل مورد نیاز آزمایشگاه، بستگی به روش کاربرد و تشخیص دارد.

کِمی لومینسانس: به طور کلی برای وسترن بلات مورد استفاده می گیرد.

ردیاب های اتیدیوم برمید دیجیتال/CCD، مادون قرمز، کِمی لومینسانس، فلورسانس 3 رنگ، چگالی سنجی و نور مرئی در دسترسند تا خوانش کمی از نوارهای اسید نوکلئیک و پروتئین، بلات های نقطه ای و میکروپلیت ها انجام گیرد.

رادیوگرافی خودکار فیلم: برای رادیوایزوتوپ ها استفاده می شود.

لیزر: حساسیت بالا و اندازه گیری دقیق برای رادیوایزوتوپ ها و انعطاف پذیری در انتخاب فیلترهای انتشار؛ از جمله فیلترهای سفارشی برای رنگهایی مانند Cy.

Multiplex: چندین سیگنال فلورسنت را همزمان و در همان آزمایشات تشخیص داده و تصویر می کند و یا سیگنال های رادیوایزوتوپی، لومینسانس و رنگ سنجی را تشخیص می دهد.

Phosphoimager: حساسیت پیشرفته برای کاربردهای فلورسانس چندگانه و رادیو ایزوتوپ ها، انعطاف در انتخاب فیلترهای انتشار، از جمله فیلترهای سفارشی.