پیپت چیست نحوه پیپت کردن و موارد استفاده از پیپت

پیپت چیست نحوه پیپت کردن و موارد استفاده از پیپت
پیپت ها
پیپت ها ابزارهایی برای انتقال یا اندازه گیری حجم های کوچک از مایعات از یک ظرف به ظرف دیگر با دقت بسیار هستند. مدل های مختلفی از پیپت ها موجود می باشد. ابتدا، آنها از شیشه ساخته می شدند؛ در حال حاضر، گزینه های انتخابی بسیاری وجود دارد. تأکید این مقاله در مورد پیپت های حجم ثابت و پیپت های حجم متغیر با کنترل مکانیکی است، اخیرا، پیپت ها با کنترل الکتریکی نیز به بازار عرضه شده اند. این مقاله درباره نگهداری و کالیبراسیون پی پت های مکانیکی صحبت می کند.

موارد استفاده از پیپت
پیپت ها ابزارهایی هستند که در آزمایشگاه های بالینی و تحقیقاتی برای برداشت حجم های کم مایعات با دقت زیاد کاربرد دارند.

اصول عملکرد پیپت
پیپت ها مکانیکی یا پیستون دار معمولا با اعمال فشار دستی روی پیستون کار می کنند. پیستون داخل یک سیلندر با طول ثابت حرکت و حجم مشخصی از مایع را به داخل یا خارج پیپت هدایت می کند.

دو نوع پیپت های پیستون دار موجود می باشد: پیپت با حجم ثابت - که حجم ثابتی از مایع را ( حجم اسمی NV: Nominal Volume) جابجا می کند و پیپت با حجم متغیر - که حجم های متفاوتی را با توجه به مشخصات اختصاصی پیپت جابجا می کند. تنظیم حجم متغیر روی پیپت با حرکت پیستون و با توجه به محدوده عملکرد پیستون انجام می شود. در این نوع پیپت ها حجم اسمی بیشترین نوع حجمی است که پیپت می تواند، نگهدارد.

انواع پیپت های ثابت و متغیر به دو نوع A و B نیز تقسیم می شوند. نوع A ( Air Displacement Pipettes): در این نوع حجمی از هوا بین سر پیستون و مایع درون سیلندر پیپت وجود دارد.

نوع B ( Positive Displacement or Direct Displacement Pipettes): در این نوع پیستون در تماس مستقیم با مایع است. پیپت های نوع A این مزیت را دارند که در استفاده بیشتر امکان آلوده شدن در آنها کمتر است؛ ولی برخلاف پیپت های نوع B وقتی برای برداشت حجم های خیلی کم مورد استفاده قرار می گیرند از دقت کافی برخوردار نیستند چون هوا در آنها متراکم و فشرده می شود.

برای به حداقل رساندن آلودگی، همه پیپت ها نوک سمپلرهای یکبار مصرف دارند. برای اطمینان از محکم بودن اتصال سر سمپلر و حجم جابجا شده به وسیله پیپت پیشنهاد شده است از سر سمپلرهای توصیه شده سازنده یا نوک سمپلرهایی که برای پیپت های حجم خاص کاربرد دارند. برای اینکه حجم های مختلف روی پیپت ها شناسایی شوند بعضی سازندگان از کدهای رنگی استفاده می کنند. جدول زیر نمایانگر این کدهای قراردادی است.

الزامات استفاده
برای استفاده از پیپت، آزمایشگاه باید به طور مطلوب تمیز و از نور کافی برخوردار باشد.

شرایط عمومی استفاده عبارت است از:

از ثابت ماندن دمای اتاق در 20 درجه سانتیگراد و تغییرات دمای 5± درجه سانتیگراد ( بین 30 - 15 درجه) اطمینان حاصل نمایید.
از رطوبت نسبی اتاق ( 50%<) اطمینان حاصل کنید. پیپت ها نمونه ها و مواد مایع باید در شرایط آزمایشگاه پایدار باشند. معمولا پیشنهاد شده است که این مواد 2 تا 3 ساعت قبل از انجام آزمایش به دمای اتاق برسند.
از کار کردن با پی پت ها در زیر نور مستقیم خورشید خودداری کنید.
اگر از مواد سمی و یا موادی که احتمال خطرات بیولوژی دارند، استفاده می شود از لوازم ایمنی و محافظ مناسب استفاده کنید.

استفاده از پیپت
برای به دست آوردن نتایج دقیق و قابل اطمینان، کاربر باید روش استفاده صحیح از پیپت را دانسته و با جزئیات کامل مراحل آشنا باشد. مراحل عمومی استفاده از پیپت به شرح زیر است:

هشدار: قبل از استفاده از پیپت، از کالیبر و مناسب بودن پی پت برای جابه جایی حجمی از مایع اطمینان حاصل نمایید.

توصیه های کلی
از قرار گرفتن پیپت در حالت عمودی در محلول اطمینان حاصل کنید. این حالت از عدم دقت در انتقال می کاهد.
از توصیه های سازنده برای حداقل قابلیت قرارگیری ( Minimum Immersion Depth) سرسمپلر و پیپت در مایع آگاه باشید. این مقدار با توجه به نوع و گنجایش پیپت متفاوت است. یک راهنمای عمومی در جدول زیر برای این منظور ارائه شده است.
برای افزایش صحت پیپت، سرسمپلرها را مرطوب کنید. برای این کار حجم کمی از محلول کاری را چند بار برداشت و داخل ظرف پسماند خالی نمایید. این کار از تشکیل حباب های هوا مخصوصا در محلول های غلیظ و یا مواد آب گریز ( Hydrophobic) خودداری می کند. همچنین سبب مرطوب شدن یکنواخت دیواره داخلی سرسمپلرها و پیستون می شود. این عمل برای پیپت ها با حجم µl 10 و یا کمتر ضروری نمی باشد.
بعد از پر کردن سرسمپلر، قطرات روی نوک سرسمپلر را تمیز نمایید. برای این کار نوک سرسمپلر را آهسته به دیواره لوله آزمایش بزنید. استفاده از کاغذ جاذب ممکن است لازم شود، در این صورت بیشتر باید دقت نمود تا از آلودگی احتمالی جلوگیری گردد.
محلول داخل سرسمپلر را در لوله آزمایش خالی کنید. این کار را با تماس نوک سرسمپلر به دیواره لوله آزمایش انجام دهید. نوک سرسمپلر باید با زاویه 45 - 30 درجه و 10 - 8 میلیمتر بالاتر از سطح مایع با دیواره لوله تماس داشته باشد.

روش صحیح پیپت کردن
در زیر مراحل متداول برای استفاده از پیپت های مکانیکی نوع A توضیح داده شده است. کاربر باید به توصیه های سازنده توجه کند. این مراحل در استفاده از پیپت های الکتریکی نیز کابرد دارد. شکل 5 این مراحل را توضیح می دهد.

یک سرسمپلر نو را با توجه به مشخصات پیپت به آن متصل نمایید. از آلوده شدن سرسمپلر با مواد دیگر جلوگیری نموده و از محکم بودن اتصال سرسمپلر اطمینان حاصل نمایید.
پیستون را تا موقعیت توقف ( First Limit) یک ( اولین مرحله) فشار دهید. در این موقعیت نوک سرسمپلر نباید با سطح مایع تماس پیدا کند.
نوک سرسمپلر را با توجه به جدول راهنما در داخل مایع قرار دهید. یا از توصیه های سازنده استفاده نمایید و پیپت را کاملا در حالت عمودی نگهداری نمایید. این حالت مطابق با موقعیت B1 ( اولی از چپ) در شکل است.
پیستون را به آرامی و به طور کامل رها کنید تا مایع را برداشت کند ( موقعیت A2). قبل از اینکه سرسمپلر را از داخل مایع خارج کنید. حداقل 2 ثانیه صبر کنید.
نوک سرسمپلر را در لوله آزمایش در زاویه 45 - 30 درجه با دیواره داخلی لوله نگهدارید. اگر لوله آزمایش که گیرنده مایع است دارای محلول است از تماس نوک سرسمپلر با محلول داخل لوله آزمایش خودداری نمایید ( موقعیت A3).
محتویات داخل سرسمپلر را با فشار دادن پیستون تا موقعیت توقف یک خالی نمایید ( موقعیت B4). در تمام مراحل اطمینان حاصل نمایید که نوک سرسمپلر و سطح داخلی لوله گیرنده مایع در تماس هستند. به آرامی نوک سرسمپلر را در سطح داخلی در ارتفاع 10 - 8 میلیمتر از سر لوله حرکت دهید تا قطره ای در نوک سرسمپلر باقی نماند.
پیستون را فشار دهید تا به موقعیت توقف ( Second Limit) دو ( دومین مرحله) برسد ( موقعیت C5). این کار قطره باقی مانده در داخل سرسمپلر را با بیرون راندن هوا خالی می کند. پیپت را تا بیرون آوردن از لوله آزمایش در همین حالت ( موقعیت C5) نگهدارید. به محض اینکه پیپت را از لوله آزمایش خارج کردید، پیستون را به حالت اولیه برگردانید.
سرسمپلر را با فشار دادن دکمه انتهای پیپت دور بیندازید ( موقعیت 6).
نکته: اگر از پیپت های متغیر استفاده می شود باید حجم مورد نیاز با توجه به راهنمایی های سازنده انتخاب شود. معمولا دکمه کنترل حجم در قسمت بالای پیپت وجود دارد. تشخیص و آشنایی کاربر با مقیاس ها ضروری است.

نگهداری معمول پیپت
روش معمول برای نگهداری پیپت های مکانیکی در ذیل آورده شده است. نگهداری اختصاصی برای مدل های مختلف با توجه به توصیه های سازنده است.

ارزیابی:
تواتر: روزانه
ارزیابی روزانه پیپت ها برای یافتن خرابی، صدمه و یا برای اطمینان از کارکرد صحیح آنها ضروری می باشد. این ارزیابی باید شامل موارد ذیل باشد:

از تنظیم و بی نقص بودن پیپت اطمینان حاصل نمایید. پیستون باید به صورت آرام و یکنواخت حرکت کند.
نگهدارنده سرسمپلر را کنترل کنید تا خراب نباشد. چون برای دقت اندازه گیری مهم است. از محکم بودن سرسمپلر هم اطمینان حاصل نمایید.
یک سرسمپلر را به پیپت متصل کنید و آن را با آب مقطر پر نمایید. پیپت نباید هیچ گونه نشتی داشته باشد.

تمیز کردن و آلودگی زدایی پیپت
هر روز پیپت با محلول یا شوینده مناسب باید تمیز شود. انتخاب محلول شوینده باید براساس توصیه های سازنده باشد.
پیپت را با توجه به توصیه های سازنده استریل کنید. بعضی پیپت ها در اتوکلاو با درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت تقریبی 20 دقیقه استریل می شوند. در بعضی از انواع پیپت ها لازم است اجزای پیپت از هم باز شوند تا بخار به قسمت های داخلی پیپت برسد. باز کردن پیپت ها باید مطابق دستورالعمل های سازنده باشد. این کار با استفاده از یک سری ابزارها و آچارهایی که زمان فروش پیپت با آن ارائه می گردد، امکان پذیر است. بعد از استریل کردن، اجزای پیپت در دمای اتاق باید دوباره به هم متصل شوند. از خشک بودن اجزای پیپت باید قبل از این کار مطمئن شد. برای استریل کردن پیپت ها بعضی سازندگان استفاده از محلول ایزوپروپانول 60%، شستن با آب مقطر، خشک کردن و سپس اتصال قطعات را پیشنهاد می دهند.
اگر از پیپت ها بری انتقال مواد خورنده و یا زیان آور استفاده شده است تمیز کردن و ضد عفونی آن قبل از استفاده دوباره و یا حذف از مراحل کاری آزمایشگاه به عهده کاربر می باشد. پیشنهاد می شود یک گزارش که در آن نوع، مدل، شماره سریال و مواد آلوده کننده و مواد مورد استفاده بعد از تمیز نمودن پیپت در آن ثبت شده است، تهیه شود.
عملکرد پی پت که روزانه مورد استفاده قرار می گیرد باید به شرح ذیل بررسی شود:

اجزای پیپت را با توجه توضیحات دفترچه راهنما باز کنید. این مراحل با توجه به مدل و شرکت سازنده متفاوت است ولی بدنه اصلی پیپت به وسیله یک پیچ باز می شود.
واشرها، پیستون و داخل سیلندر را قبل از روغن کاری تمیز کنید. اگر اجزای داخلی تصادوفا آلوده شوند، تمام سطوح با مایع شست و شوی معمولی و آب مقطر باید تمیز شوند. اگر احتیاجی به تعویض واشرها است، آنها باید با واشر مشابه و دارای مشخصات یکسان با نوع اصلی جایگزین شوند. نوع واشرها بسته به پیپت و مدل فرق می کند.
پیستون را با روغن سیلیکا مخصوص پیپت روغن کاری نمایید. از روغنی که توسط سازنده پیشنهاد شده است، استفاده نمایید. روغن اضافی را با کاغذ جاذب پاک کنید.
مراحل معکوس را برای سوار کردن قطعات پی پت انجام دهید.
پیپت را قبل از استفاده کالیبر کنید.

کالیبراسیون پی پت
کالیبراسیون پیپت ها با روش استاندارد انجام می شود. به طور کلی به حجم پیپت بستگی دارد. هرچه پیپت حجم کمتری داشته باشد، مراحل کالیبراسیون پرهرینه تر خواهد بود. یک توضیح خلاصه از مراحل کالیبراسیون ( ثقل سنجی) برای پی پت حجم های 20 میکرولیتر و 1 میلی لیتر در زیر توضیح داده شده است:

مواد و ابزار لازم
ترازوی آنالیتیک
ترمومتر الکترونیکی با درجه تفکیک1/0 درجه سانتیگراد یا بیشتر و با محدوده دمایی مناسب و قابلیت قرارگیری در آب
رطوبت سنج با عدم قطعیت استاندارد 10% یا کمتر
فشارسنج با عدم قطعیت استانداردKPa5/0 یا کمتر
تایمر
میکروپیپت ها با حجم های متغیر
سرسمپلرهای یکبار مصرف با اندازه های مختلف
ویال ها با کف صاف
آب مقطر که 2 یا 3 بار تقطیر شده باشد
کاربر آموزش دیده

تناوب زمان کالیبراسیون پی پت ها ( 3 بار در سال)
اساس کار
این مراحل براساس اندازه گیری وزن خالص آب توزیع شده به وسیله پیپت در یک ویال خالی و تقسیم آن بر چگالی آب انجام می پذیرد. در عمل، برای تهیه یک سری خوانده، وزن هر مکش ( بعد از تصحیح با عوامل دما، فشار و تبخیر) دقیقا ثبت می شود.

با این کار می توان موارد ذیل را انجام داد:

مقایسه انواع مختلف پی پت ها جهت بررسی تفاوت های آنها نسبت به هم
کنترل دقت و صحت یک پی پت
کنترل دقت و صحت یک سری از پی پت ها
کنترل عوامل موثر در استفاده از یک پی پت توسط کاربران مختلف

مراحل
مراحل زیر برای پی پت های مکانیکی کاربرد دارد.

یک سرسمپلر نو را به سمپلر متصل کنید.
آب مقطر را پیپت کنید و در ظرف دیگر خالی کنید. این کار را حداقل 5 بار تکرار کنید تا رطوبت هوای داخل پیپت ثابت شود.
آب را داخل ظرف توزین بریزید تا سطح آب حداقل به 3 میلی متر برسد.
دمای آب، فشار محیطی و رطوبت نسبی را ثبت کنید.
در ظرف توزین را در صورت امکان ببندید و وزن کنید.
وزنی را که نمایشگر روی ترازو آزمایشگاهی نشان می دهد، ثبت کنید یا آن را صفر نمایید.
آب داخل ظرف ذخیره را پی پت نمایید و داخل ظرف توزین بریزید. این کار مانند استفاده روزانه از پی پت است ( به مرحله 7 روش صحیح استفاده از پی پت مراجعه نمایید)
وزن جدید روی صفحه نمایشگر را ثبت نمایید.
مرحله ای 7 و 8 را 9 بار دیگر تکرار کنید و وزن جدید را در پایان هر مرحله ثبت نمایید.
دمای آب داخل ظرف توزین را در آخر مرحله 10 ثبت کنید. و همچنین مدت زمان انجام این مراحل را ثبت نمایید.
مقدار تبخیر آب را ارزیابی نمایید ( این مرحله برای پی پت های حجم خیلی کم خیلی مهم است). اگر با این پی پت ها کار می شود یک زمان اضافه دیگر برابر با مدت زمان لازم برای انجام مراحل 10-1، باید سپری شود و در پایان، یک خوانده جدید ثبت شود.
وزن آب تبخیر شده در زمان اضافه به تعداد کل خوانده ها ( 10 خوانده) تقسیم می شود. عدد به دست آمده نمایانگر مقدار میانگین تبخیر آب در هر مرحله است. این عدد باید به هر کدام از وزن خوانده ها افزوده شود.

محاسبات

با استفاده از مراحل زیر اقدام نمایید:

وزن آبی که هر دفعه به وسیله پی پت در ظرف توزین ریخته شده است را محاسبه کنید. برای این کار خوانده جدید را از خوانده ماقبل آخر ( برای هر خوانده) کم بکنید. در صورت لزوم میانگین مقدار آب تبخیر شده را نیز به آن اضافه نمایید.
مقدار عددی هر وزن را به یک حجم در 20 درجه سانتیگراد تبدیل کنید، وزن تقسیم بر چگالی آب در دمای 20 درجه سانتیگراد
میانگین حجم محاسبه شده در مرحله 2 را محاسبه نمایید ( مجموع حجم های قرائت شده تقسیم بر تعداد). تنظیمات مورد نظر مانند فشار هوا را به وزن ( شناوری) اعمال نمایید. برای این کار، هر خوانده وزن را به ضریب فاکتور تصحیح کننده، ضرب نمایید.
انحراف معیار را محاسبه نمایید.
درصد ضریب انحراف را محاسبه کنید.